免疫沉澱(IP)裂解液和試劑

免疫沉澱是一種能夠純化蛋白質的方法。將目標蛋白質的抗體(ti) 與(yu) 細胞提取物一起孵育，抗體(ti) 會(hui) 與(yu) 溶液中的蛋白質結合。通過使用蛋白A/G偶聯的瓊脂糖珠將抗體(ti) /抗原複合物從(cong) 樣品中提取出來 。這可以將目標蛋白質與(yu) 樣品的其餘(yu) 部分分離。然後通過SDS-PAGE分離樣品進行蛋白質印跡分析。

裂解緩衝(chong) 液

理想的裂解緩衝(chong) 液將最大限度地減少蛋白質變性，同時從(cong) 樣品中釋放足夠量的蛋白質。NP-40和Triton X-100等非離子型去汙劑的刺激性低於(yu) SDS和脫氧膽酸鈉等離子型去汙劑。其他可能影響免疫沉澱成功的變量包括了鹽濃度、二價(jia) 陽離子濃度和pH值等。為(wei) 了優(you) 化變量，應在以下範圍內(nei) 測試它們(men) ：

-鹽：0-1 M

-非離子洗滌劑：0.1-2%

-離子洗滌劑：0.01-0.5%

-二價(jia) 陽離子：0-10 mM

-EDTA：0-5 mM

-酸堿度：6-9

非變性裂解緩衝(chong) 液

用於(yu) 可溶於(yu) 去汙劑且可被抗體(ti) 以天然形式識別的抗原。Triton X-100可以替代NP-40。

-20 mM Tris HCl pH 8

-137 mM 氯化鈉

-1% Nonidet P-40 (NP-40)

-2 mM EDTA

4°C下最多可保存6個(ge) 月，使用前立即添加蛋白酶抑製劑。

為(wei) 方便起見可配製10%脫氧膽酸鈉儲(chu) 備液(5g加入50mL)，必須避光。

不含去垢劑的可溶性蛋白裂解緩衝(chong) 液

一些可溶性蛋白質可能不需要使用洗滌劑。此緩衝(chong) 液用於(yu) 機械細胞裂解，例如使用杜恩斯勻漿器進行勻漿。

PBS含有：

-5mM EDTA

4°C下最多可保存6個(ge) 月，使用前立即添加蛋白酶抑製劑。

非去汙劑可溶性抗原的變性裂解緩衝(chong) 液

僅(jin) 識別變性蛋白質的抗體(ti) 無法接近天然蛋白質的表位。收獲和裂解細胞時，在變性裂解緩衝(chong) 液中加熱細胞。該方法也可用於(yu) 無法用非離子去汙劑從(cong) 細胞中提取的抗原。使用蛋白酶抑製劑將有助於(yu) 從(cong) 染色質中提取蛋白質。

1% SDS

5mM EDTA

室溫下最多可保存1周。

使用前立即添加

10 mM二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇

蛋白酶抑製劑15 U/mL

洗滌緩衝(chong) 液

-10mM Tris;調節pH至7.4

-1mM EDTA

-1mM EGTA；pH8.0

-150mM氯化鈉

-1% Triton X-100

-0.2mM原釩酸鈉

-蛋白酶抑製劑混合物

4°C下最多可保存6個(ge) 月。使用前立即添加蛋白酶抑製劑。

其他試劑

蛋白酶抑製劑

細胞裂解後，蛋白水解、去磷酸化和變性過程就開始了。將樣品放在冰上會(hui) 減慢這些過程，但也可以使用蛋白酶和磷酸酶抑製劑混合物。如果不使用混合物，PMSF(50 μg/mL)和抑肽酶(1 μg/mL)是常用於(yu) 免疫沉澱的蛋白酶抑製劑。

其他試劑

-無菌PBS pH 7.4

-無菌PBS-BSA 1% w/v(過濾)

-TBST緩衝(chong) 液

-用於(yu) 蛋白質印跡的上樣/樣品緩衝(chong) 液

-VeriBlot用於(yu) 免疫沉澱二抗，在蛋白質印跡過程中優(you) 先檢測未還原、未變性 的一抗。

-100mM EDTA庫存溶液由1.86gEDTA溶解在40mL H2O中製成。添加NaOH 將pH調節至7.4。最後將總體(ti) 積調整至50 mL。

製備裂解物

細胞培養(yang) 物裂解物(非變性)

1，將細胞培養(yang) 皿置於(yu) 冰上，並用冰冷的PBS清洗細胞。

2，排幹PBS，然後添加冰冷的裂解緩衝(chong) 液(1mL每107個(ge) 細胞/100mm2培養(yang) 皿 /150cm2燒瓶；0.5 mL每5×106個(ge) 細胞/60mm2培養(yang) 皿或75cm2燒瓶)。

3，使用冷塑料細胞刮刀將貼壁細胞從(cong) 培養(yang) 皿上刮下，然後將細胞懸浮液輕輕轉 移至預冷的微量離心管中。

4，在4°C下保持恒定攪拌30分鍾。

5，在4°C的微量離心機中離心。

您可能需要根據細胞類型改變離心力和時間。原則是12,000 rpm，20分鍾， 但您應該針對您的特定實驗進行優(you) 化(例如，白細胞需要非常輕微的離心)。

6，輕輕地從(cong) 離心機中取出管子並置於(yu) 冰上。吸出上清液並置於(yu) 冰上的新管中， 並丟(diu) 棄沉澱。 

細胞培養(yang) 物裂解物(變性)

1，將100μL變性裂解緩衝(chong) 液添加到0.5-2×107個(ge) 細胞中。

2，以最大速度劇烈渦旋2-3秒充分混合。將細胞懸液轉移至微量離心管中。由 於(yu) DNA的釋放，溶液在此階段可能會(hui) 變得粘稠。

3，將樣品加熱至95°C，5分鍾使其變性。

4，用0.9 mL非變性裂解緩衝(chong) 液稀釋懸浮液，輕輕混合。

非變性裂解緩衝(chong) 液中過量1% Triton X-100會(hui) 淬滅原始變性緩衝(chong) 液中的SDS。

5，將裂解的懸浮液通過連接到1 mL注射器的針頭5-10次，從(cong) 而打碎DNA。

通過重複機械破壞，直到粘度降低。如果 DNA存在消化和片段化， 可能會(hui) 幹擾離心後沉澱與(yu) 上清液的分離。

6，在冰上孵育5分鍾。

7，繼續進行免疫沉澱。

組織裂解物

1，用幹淨的工具盡快解剖組織。如果可能，請在冰上進行以防止蛋白酶降解。

2，將組織放入圓底微量離心管中，浸入液氮中快速冷凍。將樣品儲(chu) 存在-80°C 下供以後使用或保存在冰上以便立即均質化。

3，對於(yu) 約5 mg的組織片，將約300 μL裂解緩衝(chong) 液快速添加到管中，並用電動 勻漿器勻漿。

4，每次衝(chong) 洗時用另外300 μL裂解緩衝(chong) 液衝(chong) 洗刀片兩(liang) 次，然後在4°C下保持恒 定攪拌2小時(例如置於(yu) 冰箱中的定軌搖床上)。

裂解緩衝(chong) 液的體(ti) 積必須根據存在的組織量來確定。蛋白質提取物不應太稀，以避免蛋白質損失並盡量減少上樣到凝膠上的樣品體(ti) 積。濃度0.1mg/mL；最佳濃度為(wei) 1–5mg/mL。

如果需要變性樣品，使用變性裂解緩衝(chong) 液並執行上述變性方案中的步驟2-5。

5，在微量離心機中於(yu) 4°C下以12,000 rpm離心20分鍾。輕輕地將管從(cong) 離心機 中取出並置於(yu) 冰上，吸出上清液並置於(yu) 冰上保存的新管中丟(diu) 棄沉澱。

預清除裂解物

預清除裂解物有助於(yu) 減少非特異性結合並降低背景。但如果蛋白質的最終檢測是通過蛋白質印跡法進行，則不需要預清除，除非汙染蛋白質幹擾了目標蛋白質的可視化。

1，將50 μL與(yu) 免疫沉澱抗體(ti) 相同種類和同種型的脫靶抗體(ti) 或正常血清(通常優(you) 先選擇兔)添加到1 mL裂解液中。在冰上孵育1小時。

2，將100 μL珠漿添加到裂解液中。

3，在 4°C下孵育10–30分鍾，並輕輕攪拌。

4，在微量離心機中於(yu) 4°C以14,000 g旋轉10分鍾。

5，丟(diu) 棄珠粒並保留上清液用於(yu) 免疫沉澱。

為(wei) 了提高產(chan) 量，可以在裂解緩衝(chong) 液中將珠子洗滌1或2次以上，並將上清液 收集在一起。

重要的是要確保盡可能多地去除正常血清。為(wei) 了確保這一點，可以使用裂解緩衝(chong) 液代替樣品進行測試，並執行上述所有預清除步驟。

將所得上清液進行凝膠電泳並用考馬斯染色顯示血清Ig是否被有效去除。如果血清未充分去除，重鏈和輕鏈將出現50和25kDa的條帶；它的存在可能會(hui) 導致免疫沉澱反應較弱。考慮減少血清量或增加預澄清步驟中與(yu) 樣品一起孵育的珠子量。