RNA提取技術 輕鬆搞定血液RNA樣本！

了解RNA提取技術的前世今生，輕鬆搞定血液RNA樣本！

RNA是基因表達的中間產(chan) 物，存在於(yu) 細胞質與(yu) 核中。RNA的提取是分子生物學研究的基礎，在進行cDNA文庫構建、體(ti) 外反轉錄、實時熒光定量PCR、Northern雜交分析等下遊分子生物學實驗時都需要高質量、高純度及完整性好的RNA。然而RNA很是“嬌弱"，一不小心就會(hui) 提取失敗。究其原因主要是RNase的內(nei) 外源性汙染。RNase是一種相對穩定遍布我們(men) 生活的一種核酸內(nei) 切酶，比如我們(men) 的雙手、實驗儀(yi) 器、周圍環境，甚至樣品本身都有RNase的存在，它能催化RNA高效降解，因此能否有效防止RNase的汙染，是提取高質量RNA的關(guan) 鍵。

1. RNA簡介

RNA是核糖核酸，其簡稱來自於(yu) RiboNucleicAcid，是存在於(yu) 生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳(chuan) 信息載體(ti) 。RNA是由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成的長鏈狀分子。與(yu) DNA不同，RNA一般為(wei) 單鏈長分子，以DNA的一條鏈為(wei) 模板，以堿基互補配對原則，轉錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現遺傳(chuan) 信息在蛋白質上的表達，是遺傳(chuan) 信息向表型轉化過程中的橋梁。有些生物，例如一些病毒，也直接使用RNA作為(wei) 遺傳(chuan) 信息的載體(ti) ，如（SARS-CoV-2）。

2. RNA提取基本原理及原則

不同組織總RNA提取實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，並通過不同方式去除多糖、酚類、蛋白以及DNA等雜質，通過一係列的抽提、洗滌和沉澱，最終獲得高純RNA產(chan) 物的過程。而RNA提取原則主要有4點：1. 保證RNA銷售結構的完整性；2. 提取的RNA樣品中不應存在對酶存在抑製作用的有機溶劑及過高濃度的金屬離子；3. 其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的汙染應降低到程度；4. 排除其它核酸分子（DNA）的汙染。

3. RNA 提取技術的發展曆程

隨著RNA的深入研究和廣泛應用，RNA提取純化技術也得到了很大的發展，從(cong) 廣泛使用地傳(chuan) 統手工法RNA提取發展為(wei) 通過核酸提取儀(yi) 來自動化提取RNA。

（1）傳(chuan) 統手工法RNA提取技術

早期的RNA提取技術

早期的RNA提取技術是異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，其原理是使用蛋白質變性劑異硫氰酸胍有效抑製RNA酶的活性，經過氯化銫介質進行密度梯度超速離心，使RNA沉澱於(yu) 管底，但這種提取方法操作複雜、流程長，一次提取的樣品數量有限並且對實驗設備要求高。後來為(wei) 解決(jue) 沒有超速離心等科研設備問題，科學家們(men) 提出了鹽酸胍-有機溶劑法，利用胍鹽抑製RNA酶，勻漿裂解細胞，有機溶劑抽提去除蛋白質，通過選擇性沉澱RNA分子而去除DNA，這種方法雖然解決(jue) 了沒有超速離心機的問題，但整個(ge) 操作過程繁雜費時。

Trizol法RNA提取技術

隨著科學技術的發展，又出現了很多手工提取純化RNA的技術，其中的是Trizol法。Trizol試劑的主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能抑製RNA酶活性。異硫氰酸胍是強有力的蛋白質變性劑，既能迅速溶解蛋白質，導致細胞結構破碎，核蛋白由於(yu) 其二級結構的破壞消失而迅速與(yu) 核酸分離，又對RNA酶有強烈的變性作用。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心後可形成水相層和有機層，這樣RNA與(yu) 仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為(wei) RNA，有機層（黃色）主要為(wei) DNA和蛋白質。Trizol試劑不但可用於(yu) 小量樣品，也可用於(yu) 大量樣品，對動物、植物、細菌、血液提取都適用，可同時處理大量不同樣品。

柱提法和磁珠法RNA提取技術

Trizol法雖然被廣泛使用，得到的RNA的質量也較好，但是Trizol試劑本身對身體(ti) 有害。因此手工提取RNA法又陸續湧現了新的技術，如矽膠柱提法和手工磁珠法，其中柱提法試劑盒采用的裂解係統，無需有毒的酚/氯仿抽提，能在迅速裂解組織或細胞的同時抑製細胞釋放出的內(nei) 源RNase，保持RNA的完整性，通過吸附柱獲得RNA。手工磁珠法的原理是磁珠表麵具有吸附作用的特定活性官能基團可特異高效地吸附核酸。將細胞裂解後，加入磁珠對核酸進行吸附，通過洗滌試劑純化去除雜質獲得純淨的核酸。但手工法RNA提取技術始終存在著耗時、繁瑣、低效率等問題。

（2）自動化RNA提取技術

近年來分子診斷技術快速發展，實驗的操作朝著更為(wei) 簡單和人性化的方向發展。分子診斷檢測的樣本類型多達數十種，而處理後RNA產(chan) 物適用的檢測項目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測序、基因芯片等各類分子生物學技術平台。然而，無論是哪一類檢測項目，準確的檢驗結果無疑依賴於(yu) 高質量的標本及標本前處理過程。磁珠法RNA提取試劑加自動核酸提取儀(yi) ，就成為(wei) 解決(jue) 臨(lin) 床分子診斷樣品前處理的組合。

4. 血液RNA樣本手工提取VS自動提取

血液由血漿和血細胞兩(liang) 部分組成，血液RNA主要存在白細胞中，紅細胞中有非常豐(feng) 富的核糖核酸酶（RNase），會(hui) 對RNA造成嚴(yan) 重的降解，最大限度地降低RNase的影響是保證血液高質量RNA提取的關(guan) 鍵。與(yu) 手工法提取相比，自動化提取血液RNA操作更加簡便、快速，可有效減少手工提取的操作失誤，同時的降低外源性RNase的汙染，確保所提RNA產(chan) 物的質量和純度。

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