​RNA 方麵的研究 完整RNA 的提取和純化

完整RNA 的提取和純化，是進行RNA 方麵的研究工作，如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體(ti) 外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個(ge) 關(guan) 鍵點，即１）：樣品細胞或組織的有效破碎；２），有效地使核蛋白複合體(ti) 變性；３），對內(nei) 源ＲＮＡ酶的有效抑製；４）有效地將ＲＮＡ從(cong) ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5），對於(yu) 多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關(guan) 鍵的是抑製ＲＮＡ酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩(liang) 種途徑，1)，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉澱出來；2)，直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與(yu) 蛋白質進入有機相而RNA 留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA 的丟(diu) 失，目前該方法的使用頻率已很低。

方法一:總RNA 的試劑盒快速提取

一些公司推出的總RNA 提取試劑盒，可以用來製備高質量的可用於(yu) 建庫的RNA 。該總RNA 純化係統采用兩(liang) 種著名的RNA 酶抑製劑，異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇，加上整個(ge) 操作都在冰浴下進行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯合使用，將促使核蛋白複合體(ti) 的解離，使RNA 與(yu) 蛋白質分離，並將RNA 釋放到溶液中。而進一步從(cong) 複合體(ti) 中純化RNA ，則根據Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進行，采用酸性酚-*混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進入水相，這樣使其與(yu) 仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉澱濃縮。進一步將上述RNA 沉澱複溶於(yu) GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉澱，隨後用乙醇洗滌沉澱，即可去除所有殘留的蛋白質和無機鹽，而RNA 中如含無機鹽，則有可能對以後操作中的一些酶促反應產(chan) 生抑製。

一：儀(yi) 器

恒溫水浴，冷凍高速離心機，紫外分光光度計，取液器，電泳儀(yi) ，電泳槽。

二：試劑

RNA 提取試劑盒，0.05%焦*(DEPC)，75%乙醇

操作步驟

(一):細胞或組織破碎

A:微生物材料

１：發酵３－４天(或對數生長期)的菌體(ti) ，離心收集菌絲(si) 體(ti) (動植物材料無需此步處理)

２：用經DEPC處理的水洗菌絲(si) 體(ti) ２－３次，並盡量除去殘存的水

３：加液氮充分研磨，使其成為(wei) 粉末，以釋放RNA

４：研磨後的樣品轉移至１２ml變性液的容器中勻漿。

B:動植物細胞培養(yang) 材料 (適用的樣品量為(wei) 細胞:108)

1:細胞或組織培養(yang) :按常規方法進行

2:深層懸浮培養(yang) 細胞的破碎:

(1)細胞收集:含一定濃度的細胞培養(yang) 液置於(yu) 無菌離心管中，4℃，3000g離心5分鍾

(2)細胞洗滌:上步沉澱用25毫升滅菌後冰凍的1×PBS緩衝(chong) 液洗滌，然後4℃，3000g離心5分鍾，

(3)細胞破碎:在沉澱細胞中加入15毫升預冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿

3:表麵培養(yang) 細胞的破碎:

(1)確定培養(yang) 瓶數量，使選定的各培養(yang) 瓶細胞累加後總量達108

(2)細胞收集:將培養(yang) 液倒掉，用預冷的無菌PBS緩衝(chong) 液洗滌一次，在培養(yang) 瓶中加入8毫升預冷變性液，轉動培養(yang) 瓶，使細胞溶解，此時可見粘度加大。

(3)用無菌吸管將第一個(ge) 培養(yang) 瓶中的液體(ti) 吸入第二個(ge) 培養(yang) 瓶，旋轉，溶解細胞，再吸入第三個(ge) 培養(yang) 瓶，以此類推，直到將所選定的培養(yang) 瓶全部洗滌一次，然後從(cong) 第一個(ge) 培養(yang) 瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yang) 瓶洗一次。

(4)將上述12毫升含細胞的變性液轉移至一50毫升無菌離心管中，勻漿破碎細胞。

C:植物組織破碎 (適用的樣品量為(wei) 0.05g組織)

(1)將600ul變性液置於(yu) 1.5ml離心管中，將此離心管放於(yu) 冰浴中5分鍾。

(2)將0.05g新鮮組織用液氮冰凍

(3)在液氮下，研磨組織塊

(4)待液氮揮發後，將上述分散的組織轉移至無菌離心管中。

D:動物組織破碎 (適用的樣品量為(wei) 1克組織)

(1)將12毫升變性液置於(yu) 50毫升離心管中，將此離心管放於(yu) 冰浴中5分鍾。

(2)在上述管中加入1克新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。

注1:研磨組織塊用於(yu) RNA 提取的樣品，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣後，不能立即用於(yu) 提取則樣品應用液氮速凍並貯於(yu) -70℃的冰箱中保存。

2:變性液及相應的離心管需預冷。

(二):RNA 的抽提

在經變性液勻漿的細胞或組織600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸鈉混勻，可用漩渦振蕩器。

600ul酚\*\*(25\24\1)，混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

冰裕中10-15分鍾，離心，4℃，10000g，20分鍾。

上層水相吸至無菌離心管中+等體(ti) 積的異丙醇，-70℃，30分鍾沉澱RNA。

離心4℃，10000g，20分鍾。

沉澱RNA ，冷凍幹燥15分鍾 ， RNA 沉澱重新溶於(yu) 300ul變性液中，可振蕩(有時為(wei) 了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應極短)。

60ulpH4.0的2M乙酸鈉混勻，可用漩渦振蕩器。

600ul酚\*\*(25\24\1)，混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

冰裕中10-15分鍾，離心，4℃，10000g，20分鍾。

上層水相吸至無菌離心管中。

等體(ti) 積異丙醇二次沉澱(-70℃，30分鍾)，７５％乙醇洗沉澱，沉澱冷凍幹燥，複溶於(yu) 去RNA 酶的水中(對於(yu) 準備長期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為(wei) 0.25M，再加入2.5體(ti) 積的乙醇，－７０℃保存。)

注：1變性液組成：25g異硫氰酸胍溶於(yu) 33mlCSB(42mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mM β-巰基乙醇)，65℃溶解，過濾滅菌，4℃預冷。

2酸性酚配製：55℃時，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層後，去上清，再反複加500ml50mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1。

方法二: 氯化鋰法提取總RNA

本方法用高濃度尿素變性蛋白並抑製RNA 酶，用氯化鋰選擇沉澱RNA ，其特別適合於(yu) 從(cong) 大量樣品中提取少量組織RNA ，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的汙染及RNA 得率不高，小RNA 片斷丟(diu) 失的缺陷。

儀(yi) 器： 同上

試劑：

氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】

懸浮液【10mM  Tris-HCL (pH7.6) ，1mM  EDTA (pH8，0) ，0.5%SDS】

其餘(yu) 同上

操作步驟：

1：對於(yu) 大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鍾；對於(yu) 少量細胞（107個(ge) 細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，並轉移至Eppendof管中

2：勻槳液在0－4℃放置4小時後，12000g離心30分鍾

3：取沉澱，加入原勻槳液1/2體(ti) 積的氯化鋰－尿素溶液，重複步驟2

4：沉澱用原勻槳液1/2體(ti) 積的氯化鋰－尿素溶液複溶後，加入等體(ti) 積酚/*/*在室溫放置15－30分鍾並不時搖動混勻，4000g離心5分鍾

5：取上層水相，加1/10倍體(ti) 積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體(ti) 積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。

6：70%乙醇洗沉澱一次。真空幹燥。

7：RNA 溶解液溶解沉澱，得RNA ，分裝，於(yu) －70℃保存。