western blot操作步驟2012版

蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette於(yu) 1981年所著的AnalyticalBiochemistry中被稱為(wei) Western Blot。最開始做印跡的是一個(ge) 叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術稱為(wei) Southern blot，後來出現了兩(liang) 個(ge) 過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個(ge) 針對RNA，一個(ge) 對蛋白質，人們(men) 分別把這兩(liang) 種技術的稱為(wei) Northern和Western，與(yu) 這兩(liang) 個(ge) 技術的發明人沒有關(guan) 係了。

一、蛋白質的樣品製備：

由於(yu) 這一步方法各異，具體(ti) 步驟請參考試劑盒的說明書(shu) 即可。蛋白質的樣品製備是Western Blotting的第一步，樣品製備是關(guan) 鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題:

> 在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重複性。

> 選擇合適的表麵活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jia) 結合的蛋白質複合物和共價(jia) 鍵二硫鍵，使其形成一個(ge) 各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等幹擾分子。

> 防止蛋白質在樣品處理過程中的人為(wei) 的修飾，製備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑製劑）。

> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質定量用），然後保存與(yu) -20°或-80℃中長期保存，但要注意不要反複凍融，因為(wei) 會(hui) 使蛋白的抗原特性發生改變。

> 若蛋白提取過程存在問題或蛋白發生降解則很難進行好之後的實驗，也就很難做出好的結果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩衝(chong) 液，同時在處理時也應注意將樣品與(yu) loading buffer混合均勻。

二、蛋白質定量

如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測波長為(wei) 562nm，Bradford為(wei) 595nm。具體(ti) 方法見各試劑盒說明書(shu) 。為(wei) 避免假陽性結果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chan) 生顏色。測完蛋白含量後，計算含50~100ug蛋白的溶液體(ti) 積即為(wei) 上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個(ge) 泳道最大能承載的蛋白質量為(wei) 150ug，所以如果從(cong) 組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。

網上有人喜歡等質量上樣（即每個(ge) 泳道的上樣體(ti) 積不一但質量一定），也有使用等體(ti) 積上樣（即先把各個(ge) 樣品稀釋到某一固定濃度，然後等體(ti) 積等質量上樣，計算上樣體(ti) 積時需包含loading buffer的體(ti) 積）。按分子克隆的說法，還是使用等體(ti) 積上樣比較好。

上樣總體(ti) 積一般不超過15ul，加樣孔的最大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品置於(yu) 燒杯內(nei) ，將燒杯置於(yu) 石棉網上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮3~5min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀(yi) 95°加熱5min，效果佳，操作方便。之後樣品可以在4℃冰箱短時間保存，也可在-20°冰箱保存數月，但是反複凍融會(hui) 使蛋白質的抗原特性改變。

三、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃板：

蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩(liang) 麵都擦洗過後用自來水衝(chong) ，再用蒸餾水衝(chong) 洗幹淨後立在筐裏晾幹。若不繼續使用，需用無水乙醇擦拭後晾幹再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應用水洗幹淨，臨(lin) 用前用無水乙醇擦拭晾幹。

2. 灌膠與(yu) 上樣

① 玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。

② 按配膠試劑盒說明書(shu) 選擇合適的分離膠濃度配置，最後加入TEMED，之後搖勻即可灌膠。配製凝膠時要充分混勻，此外應保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。灌膠時掌握好速度，避免氣泡產(chan) 生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固後膠體(ti) 積縮小越多）。然後膠上加一層水，液封後的膠凝的更快（灌膠時開始可快一些，膠麵快到所需高度時要放慢速度。

操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(hui) 有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會(hui) 被衝(chong) 變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性，操作時應該戴手套防護。梳子插入濃縮膠時，應確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為(wei) 插入的梳齒長再加1cm）。

③ 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等幾分鍾覺得差不多的時候就可倒去膠上層水並用吸水紙將水吸幹。聚合時間由AP以及TEMED決(jue) 定，通常在30min左右，AP不新鮮會(hui) 導致聚合變慢，氣溫較低時膠是會(hui) 凝得慢一些，必要時可適當增加AP以及TEMED的量，但通常不會(hui) 超過1h，若超過1h甚至更長仍未聚合，應檢查配製的操作有無錯誤。由於(yu) TEMED催化APS釋放相關(guan) 化學基團，再由APS釋放的基團催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鮮的話加再多的TEMED效果也不佳，這就是為(wei) 什麽(me) 推薦APS每周新鮮配置的原因。

④ 按說明書(shu) 配積層膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。將剩餘(yu) 空間灌滿濃縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chan) 生。插梳子時要使梳子保持水平。由於(yu) 膠凝固時體(ti) 積會(hui) 收縮減小，從(cong) 而使加樣孔的上樣體(ti) 積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩(liang) 邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固後，兩(liang) 手分別捏住梳子的兩(liang) 邊豎直向上輕輕將其拔出。

⑤ 趁積層膠聚合的這段時間，取適當體(ti) 積樣本混合1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從(cong) 冰箱裏取一管即可），95~100°加熱5min，若有沉澱可用稍低溫度，比如45~55°加熱1h達到變性的目的。我一般習(xi) 慣分裝20ul到PCR管裏，先和loading buffer混合好，臨(lin) 用前用PCR儀(yi) 加熱95°C 5min，效果不錯。

⑥ 膠做好後連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩衝(chong) 液後開始準備上樣（我們(men) 使用的是大連競邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內(nei) 測的小玻璃板，電泳槽下麵不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先衝(chong) 洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品衝(chong) 出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。

加入下一個(ge) 樣品時，進樣器需在外槽電泳緩衝(chong) 液中洗滌3次，以免交叉汙染。目前我們(men) 做的mini膠上有10個(ge) 上樣孔，一般在第一個(ge) 孔加入marker（我用的是Fermentas預染marker），其餘(yu) 9個(ge) 孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nei) 加入marker，中間8個(ge) 孔加樣品。加樣前樣品應先離心，尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中應加入等量的樣品緩衝(chong) 液。上樣時，小心不要使樣品溢出而汙染相臨(lin) 加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。

3. 電泳

電泳槽內(nei) 加入電泳緩衝(chong) 液衝(chong) 洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網上有資料建議低電壓短時間的預電泳，清除凝膠內(nei) 的雜質，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會(hui) 破壞緩衝(chong) 係統pH的不連續性。請各位按照實際經驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。電泳至溴酚蘭(lan) 剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。為(wei) 減少蛋白質條帶的擴散，上樣後應盡快進行電泳，電泳結束後也應直接或者轉印