mNGS（二代測序）將顛覆我們在感染性疾病上的認知

肺泡灌洗和痰塗片、mNGS結果均為(wei) 曲黴菌，痰和肺泡灌洗培養(yang) 出來的卻是根黴菌，哪個(ge) 環節出了問題？血mNGS結果為(wei) 貓立克次體(ti) ，序列總數53152條，而肺泡灌洗卻隻有5條支原體(ti) ？二代測序結果為(wei) 陰道加德納菌，肺泡灌洗測出70多種細菌，是操作不當還是病人存在嚴(yan) 重的衛生問題？

以上實例都是臨(lin) 床使用mNGS時出現的問題，浙大一院呼吸與(yu) 危重症醫學科的周華醫生在中青年呼吸學者論壇上進行了分享，那麽(me) ，mNGS對病原學的診斷與(yu) 傳(chuan) 統方法相比有什麽(me) 優(you) 勢？mNGS出現假陰性或假陽性時，我們(men) 該怎麽(me) 辦？為(wei) 何反複強調小心驗證的重要性？

感染性疾病診斷的核心難題是「病原診斷」

在開發出NGS技術之前，即使用遍所有的方法去診斷感染性疾病，還是會(hui) 麵臨(lin) 很多困難，也就是說很多感染性疾病的病人無法及時精準診斷病原體(ti) ，導致治療延誤或者治療不當，增加致死率，加重醫療花費。現在應用mNGS技術之後，很多病人還是無法明確病原體(ti) ，因此我們(men) 需要探索新的方法。

目前病原微生物鑒定的檢測技術有哪些？

病原學檢測方法包括培養(yang) 和非培養(yang) 的方法。其中非培養(yang) 方法包括直接塗片法，多用於(yu) 細菌、真菌、 分枝杆菌檢測；還有抗原/抗體(ti) 檢測，很早以前核酸檢測就應用於(yu) 臨(lin) 床，以前基於(yu) PCR技術或者多重PCR技術來做病原體(ti) 檢測，隨著二代測序價(jia) 格下降，二代測序就被用於(yu) 臨(lin) 床做感染病人的病原學診斷。

mNGS對病原學診斷與(yu) 傳(chuan) 統方法相比，具有什麽(me) 優(you) 勢

mNGS指宏基因組二代測序（Metagenomic Next-generation Sequencing），臨(lin) 床也稱之為(wei) 二代測序、宏基因組測序、高通量測序。

宏基因組測序（Metagenomic Sequencing）對病原學診斷與(yu) 常規的培養(yang) 相比具有理論優(you) 勢。

優(you) 勢是沒有偏移性，比如一個(ge) 標本中既有曲黴菌又有白色念珠菌，培養(yang) 時，如果白色念珠菌生長較快，便會(hui) 影響曲黴菌的生長，假如一口痰中既有白色念珠菌又有奴卡菌，白色念珠菌生長有優(you) 勢可能影響了奴卡菌的陽性率。所以培養(yang) 是有偏移性的，但理論上說，宏基因組測序對病原學診斷沒有偏移性。

優(you) 勢是廣覆蓋，對於(yu) 常規的感染性疾病的診斷來說，我們(men) 根據臨(lin) 床思維，判斷高危因素和病原體(ti) ，選擇必要的檢測手段，如果評估不全麵可能導致漏檢。理論上，宏基因組測序可以沒有偏移的把標本中所有病原體(ti) 的核酸都檢測出來，所以覆蓋麵更廣。

優(you) 勢是高效率，可以同時檢測多種病原體(ti) 。

 mNGS診斷方法的優(you) 勢：「一網打盡」

類比一下，傳(chuan) 統的病原學檢測方法如同釣魚一樣，需要加上誘餌（引物或抗原抗體(ti) ），一次隻釣一種魚，或者使用多重PCR的方法，放幾個(ge) 魚鉤一起釣，一次性釣幾種。而病原宏基因組學方法學就如同撒一張大網去全麵覆蓋各種病原菌，將可能致病的病原菌一網打盡。

二代測序除了用於(yu) 病原學診斷，還有哪些用途？

二代測序不僅(jin) 可以用於(yu) 病原學檢測，也可以在病原培養(yang) 後做深度的二代測序，甚至全基因組分析。現在主要用於(yu) 臨(lin) 床的還是臨(lin) 床標本病原學檢測，通過檢測可以知道標本中含有的病原體(ti) 。如果測序量能夠進一步突破，它除了可以把標本中裏所有微生物的核酸測出來外，也可以把人體(ti) 表達的所有RNA測出來，幫助判斷定植或者感染。比如銅綠假單胞菌測出來後，人體(ti) 有沒有針對它產(chan) 生炎症反應，還可以判斷是定植還是感染，但目前還在探索階段，尚常規未用於(yu) 臨(lin) 床。

 mNGS檢測有幾步？

目前對於(yu) 二代測序來說，給它一個(ge) 臨(lin) 床標本，不經過培養(yang) 的話，還是隻能用於(yu) 病原學診斷。使用二代測序來做病原學診斷有六個(ge) 基本步驟，一個(ge) 是采集感染部位樣本，後一步是報告解讀，中間有四個(ge) 步驟分別為(wei) 提取核酸、高通量測序、生物信息分析、檢測結果報告，這四步都不由臨(lin) 床醫生操作，由實驗室技術人員操作完成。其實我們(men) 臨(lin) 床醫生要做好一步和後一步，也要了解中間的四步，在報告解讀的時候需要了解其中的技術問題，這樣才能讀懂報告。